Bagaimana menggunakan USG untuk gangguan sel dan ekstraksi DNA/RNA?

Bagaimana cara menggunakan ultrasound untuk disrupsi sel dan ekstraksi DNA/RNA?

Ultrasound adalah teknologi yang efisien dan umum digunakan dalam disrupsi sel dan ekstraksi asam nukleat (DNA/RNA). Prinsip utamanya adalah menggunakan efek kavitasi dan getaran mekanis untuk menghancurkan struktur sel dan melepaskan zat internal. Berikut adalah penjelasan dari mekanisme spesifik, proses aplikasi, dan tindakan pencegahan utama:

I. Prinsip dan proses ultrasound untuk disrupsi sel
Inti dari disrupsi sel adalah menghancurkan membran sel (sel hewan) atau dinding sel + membran sel (tumbuhan, bakteri, jamur, dll.) untuk melepaskan zat intraseluler (seperti asam nukleat, protein, organel, dll.). Ultrasound mencapai proses ini melalui mekanisme berikut:
1. Prinsip utama: efek kavitasi
Ultrasound adalah gelombang mekanik frekuensi tinggi dengan frekuensi lebih dari 20kHz. Ketika probe ultrasonik (penguat disrupter ultrasonik) dimasukkan ke dalam sampel cair yang mengandung sel, getaran frekuensi tinggi (biasanya 15-50kHz) dihasilkan, yang memicu kavitasi dalam media cair:

Getaran frekuensi tinggi menyebabkan sejumlah besar gelembung kecil (gelembung kavitasi) terbentuk dalam cairan. Gelembung-gelembung ini mengembang dan mengkompresi dengan cepat di bawah perubahan tekanan, dan akhirnya meledak dengan keras (runtuh).
Ketika gelembung meledak, energi instan yang sangat besar (suhu tinggi lokal, tekanan tinggi, dan gelombang kejut yang kuat) akan dilepaskan, dan gaya tumbukan yang dihasilkan akan secara langsung merobek struktur membran sel (membran sel, dinding sel) untuk mencapai fragmentasi sel.
2. Efek tambahan: getaran mekanis dan gaya geser
Getaran mekanis frekuensi tinggi dari ultrasound juga akan secara langsung menghasilkan gaya geser dan gaya gesekan pada sel, yang selanjutnya membantu dalam menghancurkan struktur sel, terutama untuk sel dengan dinding sel yang tebal (seperti jamur dan sel tumbuhan).
3. Proses fragmentasi (dengan mengambil operasi eksperimen sebagai contoh)
Masukkan suspensi sel yang akan diolah (seperti cairan kultur bakteri, homogenat jaringan, dll.) ke dalam tabung sentrifus atau gelas kimia, masukkan probe ultrasonik (tanduk), dan probe perlu direndam dalam cairan tetapi tidak bersentuhan dengan dinding wadah.

Nyalakan instrumen ultrasonik dan atur parameter (daya, waktu, dll.): getaran frekuensi tinggi menghasilkan gelembung kavitasi dalam cairan, dan gaya tumbukan yang dihasilkan oleh pecahnya gelembung secara langsung menghancurkan struktur sel dan melepaskan zat intraseluler (termasuk asam nukleat, protein, metabolit, dll.).
2. Aplikasi spesifik ultrasound dalam ekstraksi DNA/RNA
Langkah-langkah inti dari ekstraksi DNA/RNA meliputi: disrupsi sel untuk melepaskan asam nukleat → penghilangan kotoran (protein, lipid, polisakarida, dll.) → pemurnian asam nukleat. Peran ultrasound terutama terkonsentrasi pada langkah pertama - disrupsi sel yang efisien dan pelepasan asam nukleat. Skenario aplikasi dan keuntungannya yang spesifik adalah sebagai berikut:
1. Jenis sampel yang sesuai
Ultrasound cocok untuk ekstraksi asam nukleat dari berbagai sampel, termasuk:

Jaringan hewan (seperti hati, otot): perlu dipotong menjadi potongan-potongan kecil terlebih dahulu, ultrasound dapat dengan cepat mendisrupsi sel dan melepaskan asam nukleat;
Bakteri/jamur: dinding sel relatif keras, metode tradisional (seperti perlakuan lisozim) tidak efisien, dan ultrasound dapat menghancurkan dinding sel melalui efek kavitasi yang kuat;
Sel kultur (sel yang menempel atau tersuspensi): suspensi langsung dan kemudian ultrasound, tidak diperlukan pra-perlakuan yang rumit;
Jaringan tumbuhan: mengandung selulosa dan pektin, ultrasound dapat membantu dalam memecah dinding sel dan melepaskan isi sel.
2. Parameter kunci dalam operasi (mempengaruhi kualitas asam nukleat)
Perlakuan ultrasonik memerlukan kontrol parameter yang ketat untuk menghindari degradasi asam nukleat atau fragmentasi yang berlebihan (mempengaruhi eksperimen selanjutnya, seperti PCR, pengurutan, dll.):

Daya: biasanya 50-300W (disesuaikan sesuai dengan jenis sampel, seperti bakteri membutuhkan daya yang lebih tinggi). Daya yang terlalu tinggi akan menyebabkan pemotongan asam nukleat terlalu pendek, dan daya yang terlalu rendah akan menghasilkan fragmentasi yang tidak mencukupi.
Waktu kerja/interval: Gunakan perlakuan "pulsa" (seperti bekerja 30 detik + jeda 30 detik) untuk menghindari pembangkitan panas ultrasonik terus-menerus yang menyebabkan denaturasi asam nukleat (DNA/RNA mudah terdegradasi pada suhu tinggi).
Total waktu perlakuan: Tergantung pada sampel (seperti 1-3 menit untuk sel hewan dan 3-5 menit untuk bakteri). Perlakuan yang berlebihan akan memperburuk fragmentasi asam nukleat.
Kontrol suhu: Bak mandi es sepanjang proses (sampel ditempatkan di atas es), karena proses ultrasonik akan menghasilkan panas (efek kavitasi disertai dengan suhu tinggi lokal), suhu rendah dapat menghambat aktivitas nuklease dan melindungi stabilitas asam nukleat.

3. Keuntungan dan tindakan pencegahan
Keuntungan
Efisiensi tinggi: Lebih cepat daripada metode tradisional (seperti penggilingan, pembekuan dan pencairan berulang, hidrolisis enzimatik) (biasanya selesai dalam beberapa menit), dan disrupsi yang lebih menyeluruh;
Universalitas: Berlaku untuk berbagai jenis sampel (hewan, tumbuhan, mikroorganisme, dll.);
Mudah dioperasikan: Tidak diperlukan reagen yang rumit, hanya diperlukan instrumen ultrasonik dan peralatan sentrifugasi dasar.
Tindakan Pencegahan
Hindari gelembung: Jika ada sejumlah besar gelembung dalam sampel, efisiensi efek kavitasi akan berkurang, dan probe dapat terlalu panas. Pastikan bahwa probe benar-benar terendam dalam cairan (tingkat cairan sekitar 1-2cm);
Inhibisi nuklease: Setelah disrupsi, larutan lisis (termasuk EDTA, deterjen, dll.) harus ditambahkan tepat waktu untuk menghambat nuklease intraseluler (seperti RNase yang mudah mengurai RNA);
Volume sampel: Volume pemrosesan tunggal tidak boleh terlalu besar (biasanya ≤5mL), jika tidak, distribusi energi ultrasonik akan tidak merata dan efek disrupsi akan sangat bervariasi.

Ringkasan
Ultrasound secara efisien mendisrupsi sel melalui efek kavitasi dan getaran mekanis, menyediakan "langkah pelepasan" kunci untuk ekstraksi DNA/RNA. Intinya adalah untuk mengoptimalkan daya, waktu, dan suhu untuk sepenuhnya mendisrupsi sel sambil memaksimalkan perlindungan integritas asam nukleat. Teknologi ini banyak digunakan pada tahap pra-pemrosesan eksperimen biologi molekuler (seperti kloning gen, qPCR, analisis transkriptom, dll.) dan merupakan alat penting untuk ekstraksi asam nukleat.